1. Молекула ДНК представляет собой спираль, образованную 2 полинуклеотидными цепями, закрученными относительно друг друга и вокруг общей оси (рис. 3.1).
2. Первичная структура цепей ДНК — это порядок чередования дезоксирибонуклеозидмонофосфатов
(dNMP) в полинуклеотидной цепи. Мононуклео-тиды связываются между собой 3',5'-фосфодиэфир-ными связями. Концы полинуклеотидной цепи различаются по структуре: на 5'-конце находится фосфатная группа, на З'-конце цепи — свободная ОН-группа.
3. Полинуклеотидные цепи в двухцепочечной молекуле ДНК расположены антипараллельно. Цепи удерживаются относительно друг друга за счет водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями А-Т и G-C. Комплементарные основания лежат в одной плоскости, которая практически перпендикулярна главной оси спирали.
Между основаниями двухцепочечной молекулы возникают гидрофобные взаимодействия, стабилизирующие двойную спираль.
Цепи комплементарны, но не идентичны друг другу, нуклеотидный состав цепей различен.
4. Каждая молекула ДНК упакована в отдельную хромосому. Хромосомы содержат разнообразные белки, связанные с определенными последовательностями ДНК. Все связывающиеся с ДНК эука-риотов белки можно разделить на 2 группы: гистоны и негистоновые белки. Комплекс белков с ядерной ДНК клеток называют хроматином.
5. Питоны — это белки небольшого размера (мол. масса около 20 000) с очень высоким содержанием положительно заряженных аминокислот (лизина и аргинина). Хроматин содержит 5 типов гистонов: Н2А, Н2В, НЗ, Н4 (нуклеосомные гистоны) и HI. Суммарный положительный заряд позволяет им прочно связываться с ДНК (рис. 3.2). Фрагмент ДНК (146 пар нуклеотидов) взаимодействует с комплексом гистонов (нуклеосомный кор), образуя нуклеосомы. Гистоны HI связываются с ДНК в межнуклеосомных участках (линкерных последовательностях) и защищают эти участки от действия нуклеаз.
---
6. Негистоновые белки — это разные типы регуля-торных белков, связывающихся со специфическими последовательностями ДНК, а также ферменты, участвующие в матричных биосинтезах.
7. Первичная структура РНК — это порядок чередования рибонуклеозидмонофосфатов (NMP) в полинуклеотидной цепи. Мононуклеотиды связываются между собой 3',5'-фосфодиэфирными связями. Различают тРНК, мРНК и рРНК; все типы РНК имеют одну полинуклеотидную цепь.
8. Отдельные участки цепей РНК образуют спи-рализованные петли — «шпильки» — за счет водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями A-U и G-C.
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ДНК
1. Для выделения ДНК из гомогената тканей удаляют фрагменты клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования. Белки, разрушенные
протеазами (чаще всего применяют протеиназу К), экстрагируют из раствора. Затем ДНК осаждают, например, этанолом и после удаления надосадочной
жидкости ДНК растворяют в буферном растворе.
2. Молекула ДНК среднего размера содержит 150 000 000 нуклеотидных пар и имеет длину 4 см.
Поэтому молекулы ДНК чувствительны к сдвиговым усилиям, возникающим в растворе, и в процессе выделения ДНК из тканей она фрагменти-руется. Получаются молекулы ДНК значительно меньше исходных, но все равно очень большие — тысячи или десятки тысяч пар нуклеотидов. Такие молекулы неудобны для исследований, и их приходится дополнительно фрагментировать.
---
Для фрагментирования используют рестриктазы — ферменты, выделяемые из бактерий. У бактерий эти ферменты участвуют в уничтожении чужеродных для них ДНК. Рестриктазы «узнают» специфические последовательности из 4—6 нуклеотидов (сайты рестрикции), которые встречаются в ДНК человека. Известно множество различных рестриктаз, причем каждая из них «узнает» свой сайт рестрикции (рис. 3.3).
С помощью набора рестриктаз можно разрезать молекулу ДНК на фрагменты желаемой длины. Например, для изучения первичной структуры удобны фрагменты размером около 300 нуклеотидных пар н.п . Следовательно, цельную молекулу ДНК в 150 000 000 н.п. нужно разрезать на 500 000 фрагментов и каждый из фрагментов изучать отдельно.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для проведения некоторых исследований необходимо большое количество хорошо очищенной высокомолекулярной ДНК. Метод ПЦР дает возможность избирательно синтезировать in vitro небольшие участки ДНК и получить за 3—4 ч несколько миллионов копий исследуемого фрагмента. Объектами для выделения ДНК могут быть кровь, биоптат ткани, слюна, моча, околоплодные воды и т.д. Подробно этот метод и его применение в ДНК-диагностике будут рассмотрены в теме 3.10.
Гибридизация. Для изучения видовой специфичности нуклеиновых кислот применяют метод гибридизации. Он основан на способности ДНК к денатурации при нагревании (80—90 °С) и ренативации при последующем охлаждении. Возможно использование метода для проведения гибридизации ДНК-ДНК и ДНК-РНК. Методом гибридизации можно установить сходство и различия первичной структуры разных образцов нуклеиновых кислот.
---
Лечение болезней - www.03.at.ua